DNA

O Ácido Desoxirribonucleico (ADN ou DNA) é o material genético de todos os organismos celulares e de grande parte dos vírus. Este material genético transporta a informação necessária para dirigir a síntese de proteínas e sua replicação. 

A síntese de proteínas nada mais é do que  a produção das proteínas as células e os vírus precisam para o metabolismo e desenvolvimento. 

A replicação é o conjunto de reações por meio das quais o DNA faz uma cópia de si mesmo cada vez que uma célula se divide e transmite suas informações às células filhas. Em quase todos os organismos celulares o DNA está organizado na forma de cromossomos, situados no núcleo celular. 

O DNA é o responsável pela transmissão das características genéticas (cor dos olhos, pele, cabelo, fisionomia, etc) entre os seres vivos.

Adesina, Citosina, Guanina e Timina são as quatro bases encontradas na estrutura do DNA.

DNA na Clonagem

1 ) Introdução

 

Até a década de 70, o DNA era o componente celular mais difícil de ser analisado. Sua sequência de nucleotídeos de enorme tamanho e monotonia química era geralmente analisada por meios indiretos como a sequência de proteínas e análise genética. A partir da década de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificação de genes específicos num processo chamado de clonagem gênica. Na verdade, muitas destas técnicas são provenientes da Microbiologia, Bioquímica, Imunologia e Genética Microbiana e permitiram que a análise do DNA ganhasse um novo enfoque. O DNA tornou-se então, a molécula mais fácil de ser analisada, sendo possível isolar regiões específicas, obtê-las em grande quantidade e determinar a sua seqüência numa velocidade de milhares de nucleotídeos por dia.

A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar este conjunto de técnicas, tem uma ampla aplicação. Ela pode ser usada para estudar mecanismos de replicação e expressão gênica, na determinação da seqüência de um gene e conseqüentemente da proteína que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substâncias úteis tais como a insulina humana, hormônio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicação comercial ou biotecnológica parece ter um potencial inesgotável.

Como conseqüência do desenvolvimento desta tecnologia é atualmente possível realizar investigação de paternidade e o diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas através da análise de DNA.
         Toda vez que um ser é gerado a partir das informações contidas num único indivíduo, por reprodução assexuada, acontece uma clonagem. Na agricultura, o homem clona vegetais há séculos. A viabilidade da produção rotineira de clones animais, e mesmo humanos, além de ainda exigir maior conhecimento científico e novas experimentações, envolve também implicações e éticas.

O êxito repetido da clonagem de animais torna mais próxima a possibilidade de clonar humanos

Passado quase um ano e meio desde o anúncio da clonagem de Dolly, a população de mamíferos clonados a partir de células adultas não-reprodutivas é de 1 ovelha britânica, dois bezerros japoneses, 50 ratos norte-americanos, alguns desses últimos, clones de clones.

 

2. Conceito de clonagem molecular:

 

A origem do termo clonagem vem da Genética Bacteriana que considera uma colônia de bactérias como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente idênticos à bactéria inicial.

A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. A clonagem molecular compreende pelo menos dois estágios importantes: primeiro o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante ou célula transformada.

Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante.

Portanto, a palavra clone vem do grego "Klon", que significa broto e  clonagem é o processo de produção assexuada, a partir de uma célula-mãe, de uma ou mais células geneticamente idênticas entre si e à original, que são os clones.

 

 


 

 


3. Meios de obtenção de clones:

 

A clonagem pode ser feita, basicamente, de duas formas: separando-se as células de um embrião em seu estágio inicial de multiplicação celular, ou pela substituição do núcleo de um óvulo por outro proveniente de uma célula de um indivíduo já existente.

A primeira forma, separação provocada das novas células de um embrião, produzirá novos indivíduos exatamente iguais, quanto ao patrimônio genético, porém diferentes de qualquer outro já existente. É um processo semelhante ao que ocorre na natureza quando da geração de gêmeos univitelinos, que tem origem a partir de um mesmo óvulo e de um mesmo esermatozóide. Este tipo de procedimento já foi realizado, de forma experimental, com embriões humanos, em 1993, pelo Prof. Jerry Hall, da Universidade George Washington, de Washington/EEUU. Foram utilizados embriões gerados para fertilização in vitro, onde foram constatadas malformações genéticas, devidas a penetração múltipla de espermatozóides no óvulo, e por isso não seriam implantados. Foram divididos 17 embriões, nos estágios de duas a oito células, resultando em 48 novos embriões. Todos os embriões gerados foram destruídos ao final do experimento, com um estágio máximo de desenvolvimento de 32 células.

A segunda forma, que reproduz assexuadamente um indivíduo igual a outro previamente existente, pela substituição do material nuclear, também denominada de duplicação, foi proposto, teoriamente, pelo Prof. Hans Speman (1869-1941), em 1938. O Prof. Speman, biólogo alemão, ganhou o Prêmio Nobel de 1935 pelas suas contribuições no estudo da evolução dos seres vivos. O primeiro experimento com sucesso já foi realizado em 1952, pelos Drs. Robert Briggs e Thomas J. King, do Instituto Carnegie/Washington-EEUU. Eles obtiveram os primeiros clones de rãs, por substituição de núcleos celulares. Durante muitos anos isto foi testado em diferentes espécies animais, especialmente mamíferos.

 

4. Etapas distintas no processo de clonagem:

 

A primeira etapa consiste na escolha do DNA a ser usado no processo de clonagem.

A segunda etapa consiste na ligação das moléculas de DNA em um vetor apropriado e na introdução em uma célula hospedeira.

A terceira etapa consiste no isolamento do gene de interesse por meio de um arsenal de técnicas genéticas, bioquímicas e imunológicas.


         A capacidade de gerar cópias (clones) praticamente infinitas de uma determinada sequência é o fundamento da Tecnologia do DNA Recombinante. O nome "DNA recombinante" refere-se a combinações novas de DNA criadas entre sequências de DNA humanas (ou outras) de interesse e moléculas de DNA bacterianas (ou outras) capazes de duplicação ilimitada no laboratório.

 

5. Enzimas de Restrição:

 

Em 1953 foi descrito um estranho fenômeno no qual a eficiência da replicação de um bacteriófago (vírus de bactérias) dependia da célula hospedeira na qual ele estava inserido. Algum tempo depois percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas era devido a presença de nucleases altamente específicas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa bacteriano que degrada DNA que lhe é estranho (restrição). A bactéria protege seu próprio DNA desta degradação "camuflando-o" através da metilação de algumas bases específicas (modificação). Como conseqüência, este sistema é frequentemente descrito como fenômeno da restrição/modificação e existe em um grande número de bactérias.

As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são divididas em várias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos sítios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo II, as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante, são proteinas monoméricas ou diméricas e clivam o DNA no mesmo sítio do seu reconhecimento. O sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é normalmente uma seqüência palindrômica, isto é, ela tem um eixo de simetria e a seqüência de bases de uma fita é a mesma da fita complementar, quando lida na direção oposta

Estas enzimas reconhecem seqüências específicas de 4 a 8 pares de base (pb) na molécula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. Há 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqüência específica, gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas.

Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrição já foram identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviação do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrição denominada de EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI, enquanto que a Hind III é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III.

O interesse por estas enzimas de restrição aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a ligação dos fragmentos. Isto significava que a recombinação poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Além disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espécie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos ou isolar proteínas de culturas bacterianas.

Uma importante conseqüência da especificidade destas enzimas de restrição é que o número de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo é definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrição gera uma família única de fragmentos quando cliva uma molécula de DNA específica. Enzimas que reconhecem sítios de restrição compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em média a cada 256 nucleotídeos (44=256). Aquelas que reconhecem sítios com 6 e 8 pb clivam o DNA em média a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente. No entanto, esta média pode sofrer variações significativas, dependendo principalmente da composição de bases do DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um sítio de restrição contendo 8pb, incluindo nucleotídeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamíferos.

A família de fragmentos gerados por digestão com enzima de restrição é geralmente detectada pela separação destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em função de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente

6. Construção do DNA Recombinante:

 

Uma enzima de restrição particular reconhece somente uma seqüência única de bases. DNAs de origem diferente sob a ação da mesma enzima de restrição produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactéria e homem) podem ser ligados por renaturação das regiões de fita simples. Além disto, se a ligação for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos serão ligados permanentemente.
A técnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de DNA clivado for um plasmídeo.

Considere como exemplo uma molécula de DNA de plasmídeo que tem somente um sítio de clivagem para uma determinada enzima de restrição. A mesma enzima é usada para clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano são misturados com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligação entre eles, uma molécula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmídeo híbrido pode ser inserido numa bactéria por transformação e então o inserto será replicado como parte do plasmídeo. Geralmente antibióticos são acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente as linhagens que portam os plasmídeos (o plasmídeo usado para esta finalidade porta resistência a pelo menos um antibiótico).

 

7. DNA ligase:

 

Conforme mencionado anteriormente esta enzima promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia .Como exemplo temos a E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactérias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacteriófago T4 requer ATP como cofator.

 

8. Objetivos ou utilidade do estudo do DNA recombinante:

 

I. Identificação da estrutura genética do organismo a que o DNA pertence ou pertenceu:

·       Identificação de pessoas desaparecidas.

·       Identificação de criminosos.

·       Testes de paternidade duvidosa.

Exemplo: identificação de pessoas e teste de paternidade:

a)Uma amostra de DNA é extraída e purificadada, a partir de glóbulos brancos do sangue de uma pessoa.

b)O DNA extraído é submetido a tratamento com enzimas de restrição, ocorrendo a fragmentação.

c)Os fragmentos obtidos são separados um dos outros através de eletroforese (técnica que permite separar os fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho e carga elétrica).

d)Comparação dos fragmentos obtidos com o DNA de outra pessoa (amostra de DNA de um cadáver com seus parentes próximos; amostra de sangue encontrado no local de um crime e suspeito do mesmo; criança e pais).

     e)A eletroforese do DNA cortado fornece um padrão típico de barrras(faixas) de cada pessoa. Para cada indivíduo, obtém-se, portanto, um padrão de barras (parecido com o código de produtos de supermercados) que consiste nas “impressões digitais” do DNA.

 

Observação: Com exceção de gêmeos univitelíneos, não existem dois indivíduos cujo DNA seja igual. Moléculas de DNA de pessoas diferentes são cortadas em pontos específicos diferentes.

f)Todas bandas presentes no DNA da criança, tem que ter vindo do pai ou da mãe, caso contrário, a paternidade será excluída. Se o pai apresentar todas bandas de DNA que não se encontrarem na mãe, a paternidade estará confirmada(confiabilidade 99,999999%).

 

II. Multiplicação do DNA extraído e posterior estudo:

·       Estudo exaustivo do gene: identificação, determinação dos nucleotídeos e, consequentemente, da sequência de aminoácidos na proteína que o gene codifica e, portanto, de sua função.

·       Comparação de genes de organismos diferentes, fornecendo informações sobre alterações ocorridas no DNA ao longo do processo evolutivo das espécies (ex. comparação do DNA do homem e do chimpanzé).

·       Expressão de genes em bactérias: introdução de genes(extraídos de outros seres vivos) em bactérias, instruindo-as a produzir determinadas substâncias que antes elas não produziam(insulina, hormônio de crescimento).

·       Produção de animais e vegetais transgênicos.

Esquerda e Direita por VERISSIMO

O DNA é de esquerda ou de direita? Ele fornece argumentos para todos. Prova que todos nascem com o mesmo sistema de códigos genéticos, e portanto são iguais — ponto para a esquerda —, mas que cada indivíduo tem uma senha diferente, ponto para a direita, se bem que não necessariamente para os racistas. Na velha questão biologia x cultura, o DNA dá razão a quem diz que características adquiridas não são hereditárias, nenhuma experiência cultural afeta os genes transmitidos e a Humanidade não ficará mais virtuosa — muito menos socialista — com o tempo. Mas a própria descoberta do DNA e todas as projeções do que se tornaram possíveis com a manipulação do material genético mostram como o ser humano pode, sim, interferir na sua própria evolução, e como existe nele uma determinação inata para o auto-aperfeiçoamento. Parafraseando Marx: os cientistas sempre se preocuparam em compreender o ser humano, agora devem tratar de mudá-lo. Biologia não é, afinal, destino. Ao mesmo tempo a eugenia é uma ciência com má reputação. Seu apogeu anterior foi nos experimentos nazistas durante a guerra, e o significado de “aperfeiçoamento” é uma questão aberta. Uma pessoa “melhora” tornando-se mais bem preparada, pela aparência, a capacidade física e o espírito empreendedor, para as competições da vida ou mais tolerante com a variedade humana? A indefinição ideológica dos nossos genes é apenas mais um numa longa lista de paradoxos que nos dividem.

É “de esquerda” ser a favor do aborto e contra a pena de morte, enquanto direitistas defendem o direito do feto à vida, porque é sagrada, e ao mesmo tempo o direito do Estado de tirá-la, embora não gostem que o Estado interfira em outras áreas. A direita valoriza o indivíduo acima da sociedade, que seria uma abstração, mas aceita a desigualdade social, ou o sacrifício de muitos indivíduos pelo sucesso de poucos, como natural. A esquerda muitas vezes atribui a um estado impessoal ou a um líder superpersonalizado a incongruente realização de um humanismo igualitário. Etcetera, etcetera. E, aparentemente, o DNA não vai nos dizer se estamos condenados a ser contraditórios de uma maneira ou de outra, para sempre. Era só o que nos faltava, o DNA ser do centrão.